Metabolômica: diferenças entre revisões
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A idéia de que os componentes dos fluidos biológicos refletem a saúde de um indivíduo existe de longo data. Antigos médicos chineses usavam formigas para a avaliar a urina de pacientes, no intuito de detectar se a urina continha altos níveis de glicose e, portanto, diagnosticar diabetes. <ref name=VDGarticle>Van der greef and Smilde, J Chemomet, (2005) 19:376-386</ref> Na [[Idade Média]], "tabelas de urina" foram utilizados para vincular as cores, sabores e cheiros de urina à várias condições médicas, que são metabólicas na origem. <ref name=JKNnature>{{cite journal |author=Nicholson JK, Lindon JC |title=Systems biology: Metabonomics |journal=Nature |volume=455 |issue=7216 |pages=1054–6 |year=2008 |month=October |pmid=18948945 |doi=10.1038/4551054a |url=}}</ref>
[[Ficheiro:FreshFrozenPlasma.JPG|thumb|right|180px|Metabolômica aplicada ao diagnóstico de doenças: a detecção ou variação de determinados metabólitos em plasma sanguíneo (imagem), urina, lágrima e outros fluidos biológicos poderiam sugerir o estado de saúde de um indivíduo]]
O conceito de que cada indivíduo poderia ter um "perfil metabólico" e que este seria refletido na composição de seus fluidos biológicos foi introduzido por Roger Williams no final da [[década de 1940]],<ref>Gates and Sweeley, Clin Chem (1978) 24(10):1663-73</ref> Utilizando [[cromatografia]] em papel, Williams e integrantes de seu grupo de estudos sugeriram padrões metabólicos característicos na urina e saliva, associando-os a doenças tais como a [[esquizofrenia]]. No entanto, foi somente através de avanços tecnológicos nas décadas de 1960 e 1970 que se tornou viável a análise quantitativa para estudas perfis metabólicos. <ref>Preti, George. "Metabolomics comes of age?" ''The Scientist'', 19[11]:8, June 6, 2005.</ref> O termo "perfil metabólico" foi introduzido por Horning e colaboradores em 1971, após demonstrarem que a cromatografia em fase gasosa-acoplada à espectrometria de massa (GC-MS) poderia ser utilizada para medir os compostos presentes na urina humana e extrato de tecidos. <ref name="VDGarticle"/><ref>Novotny et al J Chromatog B (2008) 866:26-47</ref> Durante os anos 70, o grupo de Horning, juntamente com o de [[Linus Pauling]] e Arthur Robinson desenvolveram metodologias de análise por GC-MS para monitorar os metabolitos presentes na urina.<ref>Griffiths, W.J. and Wang, Y. (2009) Chem Soc Rev 38:1882-96</ref>
Ao mesmo tempo, a espectroscopia de ressonância magnética nuclear, que foi descoberta na década de 1940, foi também objeto de rápidos avanços. Em 1974, Seeley e colaboradores demonstraram a utilidade de usar a RMN para detectar metabólitos em amostras biológicas não modificadas.<ref>{{cite journal | author=Hoult DI, Busby SJ, Gadian DG, Radda GK, Richards RE, Seeley PJ |title=Observation of tissue metabolites using 31P nuclear magnetic resonance |journal=Nature |volume=252 |issue=5481 | pages=285–7 |year=1974 |month=November |pmid=4431445 | doi=10.1038/252285a0 | bibcode=1974Natur.252..285H}}</ref> Este primeiro estudo - realizado em células musculares - determinou que 90% de ATP celular é complexado com magnésio. Como a sensibilidade da técnica melhorou com a evolução da forças do campo magnético e magia de ângulo de giro, RMN continua a ser uma ferramenta importante de análise para investigar o metabolismo.<ref name=VDGarticle/><ref name=JKNnature/> Esforços recentes para utilizar RMN em metabolômica têm sido em grande parte impulsionado pelo laboratório do Dr. Jeremy Nicholson no Birkbeck College, [[Universidade de Londres]] e posteriormente no [[Imperial College London]]. Em 1984, Nicholson mostrou que a utilização de [[RMN]] de hidrogênio-1 (<sup>1</sup>H NMR) poderia potencialmente ser usada para diagnosticar [[diabetes mellitus]], e mais tarde foi pioneiro na aplicação de métodos de reconhecimento de padrões de dados espectroscópicos.<ref>Holmes E and Antti H (2002) Analyst 127:1549-57</ref><ref>Lenz EM and Wilson ID (2007) J Proteome Res 6(2):443-58</ref>
[[Ficheiro:L Pauling.jpg|thumb|left|180px|[[Linus Pauling]]: um dos cientistas que contribuiram para o avanço das metodologias de análise de metabólitos em fluidos biológicos]]
Em 2005, o primeiro banco de dados de metabolômica para a caracterização de metabólitos humanos, o [[METLIN]],<ref name="Smith CA, I'Maille G, Want EJ, Qin C, Trauger SA, Brandon TR, Custodio DE, Abagyan R, Siuzdak G 2005 747–51">{{cite journal | author=Smith CA, I'Maille G, Want EJ, Qin C, Trauger SA, Brandon TR, Custodio DE, Abagyan R, Siuzdak G |title=METLIN: a metabolite mass spectral database |journal=Ther Drug Monit |volume=27 |issue=6| pages=747–51 |year=2005 |month=December |pmid=16404815 |url=http://masspec.scripps.edu/publications/public_pdf/107_art.pdf}}</ref> foi desenvolvido no laboratório Siuzdak no ''Scripps Research Institute'' e continha mais de 5.000 metabólitos além de dados espectroscópicos de massa em tandem. Em 2011, o METLIN possuia registrado aproximadamente 40.000 metabólitos, sendo o maior repositório de dados de espectrometria de massa em tandem em metabolômica.
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==Metabólitos==
[[Ficheiro:Metabolism diagram.svg|thumb|right|180px|[[Metabolismo|Mapa metabólico]]:Metabólitos são todos os intermediários e produtos do [[metabolismo]] de determinado organismo]]
Metabólitos são intermediários e produtos do [[metabolismo]]. Dentro do contexto da metabolômica, um metabolito é geralmente definido como qualquer molécula menor que 1 kDa.<ref>{{cite journal |author=Samuelsson LM, Larsson DG |title=Contributions from metabolomics to fish research |journal=Mol Biosyst |volume=4 |issue=10 |pages=974–9 |year=2008 |month=October |pmid=19082135 |doi=10.1039/b804196b |url=}}</ref> No entanto, existem exceções a esta, dependendo da amostra e do método de detecção. Por exemplo, macromoléculas como as [[lipoproteína]]s e [[albumina]] são detectadas de forma segura em estudos metabolômicos de [[plasma sanguíneo]] usando a técnica de RMN.<ref>{{cite journal |author=Nicholson JK, Foxall PJ, Spraul M, Farrant RD, Lindon JC |title=750 MHz 1H and 1H-13C NMR spectroscopy of human blood plasma |journal=Anal. Chem. |volume=67 |issue=5 |pages=793–811 |year=1995 |month=March |pmid=7762816 |doi= 10.1021/ac00101a004|url=}}</ref>
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===Métodos de separação===
[[Ficheiro:Gaschromatograph.jpg|thumb|right|180px|[[Cromatografia gasosa]]:Metodologia de separação empregada especialmente para análise de substâncias voláteis]]
A '''[[cromatografia gasosa]]''' ('''CG'''), especialmente quando em interface com a [[espectrometria de massa]] (GC-MS), é um dAs metodologias mais utilizadas e poderosas para a metabolômica. Oferece resolução cromatográfica muito elevada, mas requer a derivatização química para muitas [[biomolécula]]s: apenas substâncias voláteis podem ser analisadas sem derivatização. Alguns instrumentos modernos permitem o uso da cromatografia bidimensional (2D), que consiste em uma coluna polar curta disposta depois da coluna analítica principal, o que aumenta consideravelmente a resolução. Alguns metabólitos polares e com massa molecular elevada não podem ser analisados por cromatografia gasosa.<ref>{{cite journal |author=Schauer N, Steinhauser D, Strelkov S, ''et al.'' |title=GC-MS libraries for the rapid identification of metabolites in complex biological samples |journal=FEBS Lett. |volume=579 |issue=6 |pages=1332–7 |year=2005 |month=February |pmid=15733837 |doi=10.1016/j.febslet.2005.01.029 |url=}}</ref>
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A [[espectrometria de massa]] ('''EM''') é utilizada para identificar e quantificar metabólitos após a separação por CG-EM, CLAE-EM, ou EC-EM. CG-EM é a combinação mais usual dentre as três citadas anteriormente, e foi a primeira técnica hifenada a ser desenvolvida. Além disso, existem diversas bibliotecas de impressões digitais de dados espectrais disponíveis para consulta. Estas bibliotecas podem ser criadas para permitir a identificação de um metabólito de acordo com o seu padrão de fragmentação. A EM é uma técnica bastante sensível e pode dados bastante específicos sobre um determinado analito. Há também um número de estudos que utilizam EM como uma tecnologia autonôma: a amostra é injetada diretamente no espectrômetro de massas sem a necessidade de uma separação prévia: o aparelho é usado então tanto para separar como detectar os metabólitos.
[[Ficheiro:GCMS closed.jpg|thumb|left|200px|[[Cromatografia gasosa]] acoplada a [[Espectrometria de Massas]] (CG-EM): Associação entre uma técnica de separação e outra de detecção amplamente utilizada em estudos de metabolômica.]]
A capacidade de analisar metabólitos diretamente em fluidos e tecidos biológicos continua a desafiar a tecnologia atual de EM, em grande parte por causa dos limites impostos pela complexidade dessas amostras, que contêm milhares a dezenas de milhares de metabólitos. Entre as tecnologias desenvolvidas para tentar resolver este desafio está a '''NIMS''' (Nanostructure-Initiator MS)<ref>{{cite journal |author=Northen T.R, Yanes O, Northen M, Marrinucci D, Uritboonthai W, Apon J, Golledge S, Nordstrom A, Siuzdak G |title=Clathrate nanostructures for mass spectrometry |volume=449 |issue=7165 |pages=1033–6 |year=2007 |journal=Nature |month=October |pmid=17960240 |doi=10.1038/nature06195 |url=}}</ref><ref>{{cite journal |author=Woo H, Northern TR, Yanes O, Siuzdak G |title=Nanostructure-initiator mass spectrometry: a protocol for preparing and applying NIMS surfaces for high-sensitivity mass analysis |volume=3 |issue=8 |pages=1341–9 |year=2008 |journal=Nature protocols |month=July |pmid=18714302 |doi=10.1038/nprot.2008,110 |url=}}</ref>, que é uma abordagem para dessorção/ionização da amostra que não requer a o uso de uma matriz e, assim, facilita a identificação de moléculas pequenas (isto é, os metabólitos). A tecnologia '''MALDI''' (Matrix-assisted laser desorption/ionization) também é utilizada, no entanto a aplicação desta pode adicionar fundo significativo de aproximadamente 1000 Da, fato que dificulta a análise da gama de substâncias de baixa massa molecular. Devido a estas limitações, outras matrizes isentas de abordagens de dessorção/ionização têm sido aplicadas para a análise de fluidos e tecidos biológicos, como por exemplo a '''SIMS''' (Secondary ion mass spectrometry), que foi uma das primeiras matrizes livres de dessorção/ionização e tem sido utilizada para analisar metabolitos em amostras biológicas. SIMS utiliza feixe de íons primários de alta energia para dessorver e gerar íons secundários a partir de uma superfície. A principal vantagem da SIMS é a sua alta resolução espacial (50 nm), uma característica poderosa para [[imagiologia]] de tecidos usando EM. No entanto, SIMS ainda não é prontamente aplicada à análise de fluidos biológicos e tecidos, devido à sua sensibilidade limitada a >500 Da e também pela fragmentação do analito gerado pelo feixe de íons de alta energia primária. Outra tecnologia exzstente é a '''DESI''' (Desorption electrospray ionization): trata-se de uma matriz para analisar amostras biológicas utilizando pulverização de solvente carregado para desabsorver íons a partir de uma superfície. As vantagens do DESI são de que nenhuma superfície especial é necessária e a análise é realizada à pressão ambiente com acesso total à amostra durante a aquisição dos dados. A resolução espacial no entanto torna-se uma limitação da DESI, pois a concentração do ''spray'' de solvente carregado é difícil. No entanto, um recente desenvolvimento denominado de laser ablação ESI (LAESI) é uma abordagem promissora para contornar essa limitação.▼
▲A capacidade de analisar metabólitos diretamente em fluidos e tecidos biológicos continua a desafiar a tecnologia atual de EM, em grande parte por causa dos limites impostos pela complexidade dessas amostras, que contêm milhares a dezenas de milhares de metabólitos. Entre as tecnologias desenvolvidas para tentar resolver este desafio está a '''NIMS''' (Nanostructure-Initiator MS)<ref>{{cite journal |author=Northen T.R, Yanes O, Northen M, Marrinucci D, Uritboonthai W, Apon J, Golledge S, Nordstrom A, Siuzdak G |title=Clathrate nanostructures for mass spectrometry |volume=449 |issue=7165 |pages=1033–6 |year=2007 |journal=Nature |month=October |pmid=17960240 |doi=10.1038/nature06195 |url=}}</ref><ref>{{cite journal |author=Woo H, Northern TR, Yanes O, Siuzdak G |title=Nanostructure-initiator mass spectrometry: a protocol for preparing and applying NIMS surfaces for high-sensitivity mass analysis |volume=3 |issue=8 |pages=1341–9 |year=2008 |journal=Nature protocols |month=July |pmid=18714302 |doi=10.1038/nprot.2008,110 |url=}}</ref>, que é uma abordagem para dessorção/ionização da amostra que não requer a o uso de uma matriz e, assim, facilita a identificação de moléculas pequenas (isto é, os metabólitos). [[Ficheiro:NMR-Spectrometer.png|thumb|right|120px|Um espectrômetro de ressonância magnética nuclear (RMN): outra metodologia de detecção muito utilizada em metabolômica.]]A tecnologia '''MALDI''' (Matrix-assisted laser desorption/ionization) também é utilizada, no entanto a aplicação desta pode adicionar fundo significativo de aproximadamente 1000 Da, fato que dificulta a análise da gama de substâncias de baixa massa molecular. Devido a estas limitações, outras matrizes isentas de abordagens de dessorção/ionização têm sido aplicadas para a análise de fluidos e tecidos biológicos, como por exemplo a '''SIMS''' (Secondary ion mass spectrometry), que foi uma das primeiras matrizes livres de dessorção/ionização e tem sido utilizada para analisar metabolitos em amostras biológicas. SIMS utiliza feixe de íons primários de alta energia para dessorver e gerar íons secundários a partir de uma superfície. A principal vantagem da SIMS é a sua alta resolução espacial (50 nm), uma característica poderosa para [[imagiologia]] de tecidos usando EM. No entanto, SIMS ainda não é prontamente aplicada à análise de fluidos biológicos e tecidos, devido à sua sensibilidade limitada a >500 Da e também pela fragmentação do analito gerado pelo feixe de íons de alta energia primária. Outra tecnologia exzstente é a '''DESI''' (Desorption electrospray ionization): trata-se de uma matriz para analisar amostras biológicas utilizando pulverização de solvente carregado para desabsorver íons a partir de uma superfície. As vantagens do DESI são de que nenhuma superfície especial é necessária e a análise é realizada à pressão ambiente com acesso total à amostra durante a aquisição dos dados. A resolução espacial no entanto torna-se uma limitação da DESI, pois a concentração do ''spray'' de solvente carregado é difícil. No entanto, um recente desenvolvimento denominado de laser ablação ESI (LAESI) é uma abordagem promissora para contornar essa limitação.
A espectroscopia de ressonância magnética Nuclear de ('''RMN''') é uma técnica de detecção que não se baseia na separação dos analítos, e assim, a amostra pode ser recuperada para análises posteriores. Todos os tipos de metabólitos (moléculas pequenas) podem ser analisados simultaneamente - neste sentido, de RMN é quase um detector universal. As principais vantagens da RMN são a reprodutibilidade analítica elevada e a simplicidade de preparação da amostra. No entanto, é relativamente insensível em relação a espectrometria de massa com base em técnicas.<ref>{{cite journal |author=Griffin JL |title=Metabonomics: NMR spectroscopy and pattern recognition analysis of body fluids and tissues for characterisation of xenobiotic toxicity and disease diagnosis |journal=Curr Opin Chem Biol |volume=7 |issue=5 |pages=648–54 |year=2003 |month=October |pmid=14580571 |doi= 10.1016/j.cbpa.2003.08.008|url=}}</ref><ref>{{cite journal |author=Beckonert O, Keun HC, Ebbels TM, ''et al.'' |title=Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts |journal=Nat Protoc |volume=2 |issue=11 |pages=2692–703 |year=2007 |pmid=18007604 |doi=10.1038/nprot.2007.376 |url=}}</ref>
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==Métodos estatísticos==
[[Ficheiro:EI-MS-2.jpg|thumb|left|200px|Um espectro de massas: a utilização de programas e análise estatística fornece a identificação dos metabólitos existentes na amostra.]]
Os dados gerados pelos estudos de metabolômica geralmente consistem de medidas realizadas em indivíduos sob várias condições. Estas medidas podem gerar espectros digitalizados ou uma lista de níveis de metabolitos. Na sua forma mais simples, uma amostra gera uma linha de dados correspondente aos indivíduos em estudo e outra correspondentes aos níveis de metabolitos.<ref name="VDGarticle"/> Diversos programas estatísticos estão disponíveis atualmente tanto para a análise de dados de RMN quanto de espectrometria de massa. Para os dados de espectrometria de massa, os softwares disponíveis identificam a variação de moléculas em um grupos de sujeitos levando em consideração a massa molecular e por vezes, o tempo de retenção de acordo com o desenho experimental.
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==Aplicações==
[[Ficheiro:Arancia di Ribera byFigiu.JPG|thumb|right|180px|Manipulação genética: a metabolômica pode fornecer ferramentas para detectar qualquer alteração fenotípica em uma planta geneticamente modificada para consumo humano ou animal.]]
Avaliação de [[toxicidade]]/[[toxicologia]]. O perfil metabólico (especialmente de amostras de urina ou plasma sanguíneo) pode ser usado para detectar alterações fisiológicas provocadas pela agressão tóxica de um produto químico (ou mistura de produtos químicos). Em muitos casos, as alterações observadas podem estar relacionadas a síndromes específicas, por exemplo uma lesão no fígado ou nos rins. Isto é de particular relevância para as empresas farmacêuticas que querem testar a toxicidade de substâncias candidatas a se tornarem fármacos: se uma substância pode ser descartada antes de chegar aos ensaios clínicos em razão da toxicidade adversa, isto economizaria despesas adicionais com ensaios<ref name=DGRref/>.
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