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Uma das etapas para análise de uma amostra complexa, mas não obrigatória, é a aplicação de metodologias cromatográficas visando a separação dos metabólitos. Uma amostra pode conter dezenas, centenas ou mesmo milhares de substâncias. Experimentalmente, é possível isolar parte destes compostos, para que posteriormente, estes sejam identificados através de métodos de elucidação estrutural. Embora o metaboloma possa ser analisado prontamente, ainda não é possível monitorar toda a gama de metabólitos de uma amostra utizando apenas uma único método analítico.
Dentre as técnicas mais empregadas nos estudos metabolômicos está a '''[[cromatografia gasosa]]''' (CG), especialmente quando em interface com a [[espectrometria de massa]] (GC-MS) <ref name=Dunn/>. Oferece resolução cromatográfica muito elevada, mas requer a [[derivatização]] química para muitas [[biomolécula]]s: apenas [[Volatilidade|substâncias voláteis]] podem ser analisadas sem derivatização. Alguns instrumentos modernos permitem o uso da cromatografia bidimensional (2D), que consiste em uma coluna polar curta disposta depois da coluna analítica principal, o que aumenta consideravelmente a resolução. Alguns metabólitos polares e com massa molecular elevada não podem ser analisados por cromatografia gasosa.<ref>{{cite journal |author=Schauer N, Steinhauser D, Strelkov S, ''et al.'' |title=GC-MS libraries for the rapid identification of metabolites in complex biological samples |journal=FEBS Lett. |volume=579 |issue=6 |pages=1332–7 |year=2005 |month=fevereiro|pmid=15733837 |doi=10.1016/j.febslet.2005.01.029 |url=}}</ref>
A '''[[cromatografia líquida de alta eficiência]]''' (CLAE) quando comparada a CG, possui menor resolução cromatográfica, mas tem a vantagem de que uma gama maior de analitos podem potencialmente ser analisados.<ref>{{cite journal |author=Gika HG, Theodoridis GA, Wingate JE, Wilson ID |title=Within-day reproducibility of an LC-MS-based method for metabonomic analysis: application to human urine |journal=J. Proteome Res. |volume=6 |issue=8 |pages=3291–303 |year=2007 |month=agosto |pmid=17625818 |doi=10.1021/pr070183p |url=}}</ref>
A '''[[Eletroforese|eletroforese capilar]]''' (EC) tem uma eficiência de separação teoricamente superior à CLAE, e é adequada para analisar uma vasta gama de classes de metabólitos do que a GC. Como para todas as técnicas eletroforéticas, é mais apropriada para analitos eletricamente carregados.<ref>{{cite journal |author=Soga T, Ohashi Y, Ueno Y |title=Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry |journal=J. Proteome Res. |volume=2 |issue=5 |pages=488–494 |year=2003 |month=setembro |pmid=14582645 |doi=10.1021/pr034020m |url= }}</ref>
===Métodos de detecção===
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