O jogo conta com todos os três personagespersonagens principais da série até agora: [[Altaïr ibn La-Ahad]], [[Ezio Auditore da Firenze]] e [[Desmond Miles]]. O jogo se passa no ano de [[1511]] d.C., Ezio Auditore da Firenze, já um homem idoso, está em busca de segredos escondidos pelo seu lendário antepassado Altaïr em [[Masyaf]], antigo lar da [[Ordem dos Assassinos]]. Após ser surpreendido pelos Templários, Ezio viaja até a capital do [[Império Otomano]], [[Istanbul#Turkish rule|Istanbul (Constantinopla)]], que está dividida em quatro distritos para encontrar misteriosas chaves escondidas pelo explorador [[Nicolau Polo]] (pai do também explorador [[Marco Polo]]), se estas chaves cairem nas mãos dos Templários, poderão destruir segredos não só dos Assassinos, mas de toda a história da humanidade.
