Sequenciamento de DNA: diferenças entre revisões

Em cada um dos nanopoços está ocorrendo milhares de reações ao mesmo tempo, onde uma câmera CCD é responsável por filmar a placa e enviar todos os dados para um computador. Chegando ao computador, poderá ser realizada a identificação da sequência de cada nanopoço, através da análise dos picos luminosos gerados pela adição de cada nucleotídeo. O pirosequenciamento é considerado um método mais eficiente que o método de Sanger se considerarmos que a cobertura da sequencia é muito maior, sendo uma determinada base lida várias vezes. Entretanto, o método tem como contrariedade a necessidade de usar um numero maior de reagentes.

 

O DNA é clivado em fragmentos aleatórios e pequenos de 300-500pb e são então ligados a adaptadores que possuem uma sequência específica que permite a ligação desse fragmento a microesferas de captura de DNA.

 

A reação em cadeia da polimerase (português brasileiro) ou simplesmente PCR- Polimerase Chain Reaction (termo inglês), trata-se de uma técnica de biologia molecular utilizada atualmente para diferentes tipos de estudos que segue desde caracterização de diversidade genética das espécies até exames de paternidade e á elucidação de crimes ligados a biologia forense. Essa técnica é basicamente utilizada para amplificar determinados trechos de DNA dos organismos assim permitindo uma maior facilidade de analises dos mesmos.

 

As microesferas são ressuspendidas em uma mistura de reagentes de PCR, água, dNTPs, oligonucleotídeos iniciadores e Taq DNA-polimerase para a amplificação do fragmento. Cada gotícula possui uma microesfera, assim funcionando como um microrreator sem contaminantes ou sequências competidoras. Após a PCR, as microesferas com os seus respectivos fragmentos são depositadas em uma placa onde cada poço possui apenas uma microesfera. A placa do sequenciamento contém 1,6 milhões de poços.

 

O DNA é sequenciado em ciclos, e a cada ciclo um nucleotídeo é adicionado à reação. Se o nucleotídeo conhecido adicionado for incorporado à sequência um sinal de luz é emitido. Um dos quatro dNTPs é adicionado ao poço, se o dNTP for complementar ao DNA molde e incorporado à sequencia a DNA polimerase cataliza a sua inserção e libera um íon pirofosfato.