A história do jogo acontece 15 anos após o início de seu anterior, e se passa após o final da sequência 12 e antes da sequência 13 de Assassins Creed II. Segue-se protagonista do jogo anterior, [[Ezio Auditore da Firenze]], ele viaja para a Espanha do século XV para libertar seus companheiros assassinos, que foram presos sob o pretexto da Inquisição Espanhola. No processo, ele descobre que os cavaleiros templários estão planejando navegar para o oeste para "descobrir" um Novo Mundo (o continente da América, sendo que os templários, diferente de muitos europeus, aparentam já conhecer a existência desse continente). Ezio tinha que salvar Christoffa ou [[Cristóvão Colombo]] e matar Tomas Torquemada para acabar com a ameaça dos Templários. Ezio também teve que assassinar alguns outros alvos importantes, tais como: Gasper Martinez, Pedro Llorente, um espião dos Templários, e Juan de Marillo. Ao longo do caminho Ezio salva muitos assassinos que o ajudam, incluindo Luis de Santangel e Raphael Sanchez. Também Ciudad de Granada é tomada sob o cerco pelos Templários e Ezio tem que salvar o rei [[Mouros|mouro]] Muhammad XII. Ezio também encontra a [[rainha Isabel]].
