PCR quantitativo em tempo real: diferenças entre revisões

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Na [[biologiaBiologia molecular|Biologia Molecular]], a qPCRo '''quantitativoPCR em tempo real''' (do inglês: real-time ''Reverse transcription polymerase chain reaction quantitative real time''), curto:também RT-qPCRconhecido oucomo qRT-PCR quantitativo (qPCR) é uma técnica de laboratório baseada no princípio da [[reação em cadeia da polimerase]] (PCR). paraO multiplicarprocedimento monitora os níveis de [[Ácido nucleico|ácidos nucleicos]] edurante quantificara o [[Ácido desoxirribonucleico|DNA]] obtidoamplificação, ondediferentemente o material genético inicial na reação dedo PCR é RNA, que é transcritoconvencional no reversoqual ema seuquantificação complementoocorre desomente DNAapós poro enzimafinal transcriptaseda reversaamplificação.
 
Já a '''PCR quantitativo em tempo real''' (do inglês: ''Polymerase chain reaction quantitative real time''), curto: qPCR é uma técnica baseada no princípio da reação da cadeia polimerase onde uma máquina qPCR e um corante fluorescente na sua reação de PCR (Sybr green ou Taqman Probe) se liga ao seu produto genético amplificado e dá-lhe um valor Ct, o que mais tarde lhe dará uma idéia sobre a quantidade do DNA na sua reação dependendo dos padrões usados.
 
A reação em cadeia de polimerização em tempo real combina a metodologia de PCR convencional com um mecanismo de detecção e quantificação por fluorescência. A metodologia permite que os processos de amplificação, detecção e quantificação de DNA sejam realizadas em uma única etapa, agilizando a obtenção de resultados e diminuindo o risco de contaminação da amostra e dando maior precisão.
 
== BibliografiaPrincípios do PCR ==
O PCR permite a amplificação de um segmento específico de DNA a partir de uma mistura complexa de DNA contendo uma pequena quantidade do material de interesse<ref name=":0">{{Citar periódico |titulo=Polymerase Chain Reaction |acessodata=2021-01-06 |publicado= |ultimo2=Avashia |primeiro2=Nidhi |ultimo=Garibyan |primeiro=Lilit |doi=10.1038/jid.2013.1 |numero=3 |url=https://dx.doi.org/10.1038/jid.2013.1 |pmid=23399825 |pmc=4102308 |paginas=1–4 |issn=0022-202X |data=2013-03 |jornal=Journal of Investigative Dermatology |pagina=}}</ref>. O protocolo exige a presença da amostra a ser analisada, [[Iniciador|primers]], [[DNTP|dNTPs]] e [[ADN polimerase|DNA polimerase]]<ref name=":0" />. Geralmente, a amostra a ser analisada consiste no DNA complementar (cDNA) resultante da [[Retrotranscrição|transcrição reversa]] do RNA. Os primers são fragmentos curtos de DNA de fita simples, complementares à sequência de interesse. Geralmente há um primer ''forward'' e um primer ''reverse.'' Os dNTPs são os nucleotídeos livres ATP, GTP, TTP e CTP, que contém as bases adenina, guanina, timina e citosina, respectivamente. A DNA polimerase é a enzima que catalisa a síntese do DNA, e é geralmente isolada da [[bactéria]] [[Organismo termófilo|termofílica]] ''Thermus aquaticus''.
* MACKAY, I.M. et al. Real-time PCR in virology. In: Nucleic Acids Research 30(6) 1292-1305, 2002.
 
* MACKAY, I.M. et al. Real-time PCR in microbiology laboratory. In: Clin Microbiol Infet 10(3) 190-212, 2004.
A mistura contendo os componentes mencionados acima são submetidos a vários ciclos em um termociclador. Cada ciclo possui três etapas<ref>{{Citar livro |url=https://www.worldcat.org/oclc/986827885 |título=Lehninger principles of biochemistry |ultimo=Nelson, David L. (David Lee), 1942- |ultimo2=Lehninger, Albert L. |edicao=Seventh edition |local=New York, NY |oclc=986827885}}</ref>:
* SAUNDERS, N.A Real-time PCR In: Methods Mol Biol 266: 191-211, 2004.
 
1 - [[Desnaturação do ADN|Desnaturação]] (''melting''), com aumento de temperatura, para que as duas fitas do cDNA se separem.
 
2 - Anelamento (''anneling''), com diminuição da temperatura, para que os primers pareiem com as sequências-alvo no DNA.
 
3 - Síntese, na qual a temperatura é a ideal para a atividade da DNA polimerase. A sequência reconhecida pelo primer é replicada.
 
Estes ciclos ocorrem de 30 a quarenta vezes, até que a sequência de interesse esteja suficientemente amplificada.
 
== Métodos de detecção no qPCR ==
Os métodos mais comuns de detecção no qPCR são (1) corantes fluorescentes que se ligam a DNA de dupla fita e (2) sondas específicas a certas sequências de DNA<ref name=":0" />.
 
Quanto ao primeiro método de detecção, o corante mais utilizado é o SYBR Green, que emite uma [[fluorescência]] maior quando ligado ao sulco menor do DNA de dupla fita, em comparação ao corante livre na solução<ref name=":1">{{Citar periódico |titulo=Comparison of SYBR Green and TaqMan methods in quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of four adenosine receptor subtypes |lingua=en |publicado= |ultimo3=Javanmard |primeiro3=ShaghayeghHaghjooy |ultimo2=Panjehpour |primeiro2=Mojtaba |ultimo=Tajadini |primeiro=Mohamadhasan |doi=10.4103/2277-9175.127998 |url=http://www.advbiores.net/text.asp?2014/3/1/85/127998 |acessodata=2021-01-06 |numero=1 |pmid=24761393 |pmc=3988599 |paginas=85 |issn=2277-9175 |data=2014 |jornal=Advanced Biomedical Research |pagina=}}</ref>. Deste modo, quanto maior a quantidade de DNA de fita dupla em solução, maior o sinal fluorescente. O SYBR Green é não-específico, de modo que pode se ligar a qualquer sequência de DNA de fita dupla. O seu pico máximo de excitação ocorre a 497nm, enquanto o pico de emissão ocorre a 520nm<ref>{{citar web |ultimo= |primeiro= |url=https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/Datasheet/s9430dat.pdf |titulo=Product information - SYBR Green I nucleic acid gel stain |data= |acessodata=06-01-2021 |publicado=Sigma-Aldrich}}</ref>.
 
Em relação ao segundo método de detecção, o método mais conhecido é o TaqMan. O protocolo exige uma DNA polimerase com atividade [[nuclease]] 5’ e uma sonda. A sonda consiste em curto [[oligonucleotídeo]] de fita simples específico contra o fragmento de interesse, com um [[fluoróforo]] repórter em sua extremidade 5’ e um ''quencher'' em sua extremidade 3’<ref name=":1" />. A sonda se liga ao DNA de interesse quando este está em sua forma desnaturada. Quando a sonda está intacta, o ''quencher'' impede a emissão de sinal pelo repórter. Durante a fase de amplificação, a atividade de nuclease da DNA polimerase hidrolisa o oligonucleotídeo da sonda ligada ao DNA, de modo que o repórter e o ''quencher'' são separados e sinal fluorescente é emitido<ref>{{Citar web |url=https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-learning-center/real-time-pcr-basics/how-taqman-assays-work.html |titulo=How TaqMan Assays Work - US |acessodata=2021-01-06 |website=www.thermofisher.com |lingua=en}}</ref>.
 
== Referências ==
<references />
 
== Ver também ==
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