Diferenças entre edições de "PCR quantitativo em tempo real"

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Em relação ao segundo método de detecção, o método mais conhecido é o TaqMan. O protocolo exige uma DNA polimerase com atividade [[nuclease]] 5’ e uma sonda. A sonda consiste em curto [[oligonucleotídeo]] de fita simples específico contra o fragmento de interesse, com um [[fluoróforo]] repórter em sua extremidade 5’ e um ''quencher'' em sua extremidade 3’<ref name=":1" />. A sonda se liga ao DNA de interesse quando este está em sua forma desnaturada. Quando a sonda está intacta, o ''quencher'' impede a emissão de sinal pelo repórter. Durante a fase de amplificação, a atividade de nuclease da DNA polimerase hidrolisa o oligonucleotídeo da sonda ligada ao DNA, de modo que o repórter e o ''quencher'' são separados e sinal fluorescente é emitido<ref>{{Citar web |url=https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-learning-center/real-time-pcr-basics/how-taqman-assays-work.html |titulo=How TaqMan Assays Work - US |acessodata=2021-01-06 |website=www.thermofisher.com |lingua=en}}</ref>.
 
== Quantificação ==
[[Ficheiro:Qpcr-cycling.png|miniaturadaimagem|236x236px|Limiar do Ct. O valor de Ct corresponde ao número do ciclo no qual a curva de PCR cruza o limiar. O limiar é representado pela linha horizontal vermelha. As curvas de PCR à esquerda apresentam menor Ct.]]
Os dados de qPCR podem ser analisados como quantificação absoluta ou relativa. Na quantificação absoluta, o número total de cópias do produto do PCR é obtido após comparação com uma curva padrão.
 
Já na quantificação relativa, no qual o sinal da sequência de interesse é comparado com o de um controle, sendo o método do 2<sup>−ΔΔ''Ct''</sup> o mais utilizado<ref name=":2">{{Citar periódico |titulo=Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method |url=https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1046202301912629 |jornal=Methods |data=2001-12 |paginas=402–408 |numero=4 |acessodata=2021-01-06 |doi=10.1006/meth.2001.1262 |lingua=en |primeiro=Kenneth J. |ultimo=Livak |primeiro2=Thomas D. |ultimo2=Schmittgen}}</ref>. Para este método, mede-se o valor de Ct, que é o número do ciclo em que o sinal de fluorescência emitido durante o qPCR atinge um limiar significantemente acima da fluorescência de fundo. Menores valores de Ct indicam maiores níveis de expressão, pois são necessários menos ciclos de amplificação para atingir o limiar. Já maiores valores de Ct indicam menores níveis de expressão<ref name=":3">{{citar web |ultimo= |primeiro= |url=https://genomique.iric.ca/resources/files/Understanding_qPCR_results |titulo=Understanding qPCR results |data= |acessodata= |publicado=Institute of research in immunology and cancer, University of Montreal}}</ref>.
 
É necessário medir os valores de ''Ct'' do gene-alvo e de um gene de expressão endógena, o qual geralmente é um [[gene de manutenção]]. Um exemplo de gene endógeno frequentemente utilizado é a [[Actina|β-actina]]. Os valores de ''Ct'' devem ser medidos em condições de tratamento e de controle. A equação para quantificação por 2<sup>−ΔΔ''Ct''</sup> é<ref name=":2" />:
 
<math>quantidade\ relativa = 2^{-\Delta\Delta Ct}</math>
 
Sendo que:
 
<math>-\Delta \Delta Ct = \Delta Ct_{tratamento} - \Delta Ct_{controle}</math>
 
 
<math>\Delta Ct = Ct_{gene\ de\ interesse} - Ct_{gene\ end\acute{o}geno}</math>
 
2<sup>−ΔΔ''Ct''</sup> corresponde ao valor de ''fold-change'' dos níveis de expressão durante o tratamento em relação ao controle. Um valor de 2<sup>−ΔΔ''Ct''</sup> igual a um indica níveis de expressão semelhantes entre o tratamento e a condição controle, valores significantemente maiores que 1 indicam expressão aumentada no tratamento, e valores significantemente abaixo de 1 indicam expressão gênica diminuída no tratamento<ref name=":3" />. O valor de 2<sup>−ΔΔ''Ct''</sup> não possui unidade.
 
== Referências ==
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