Sequenciamento de DNA: diferenças entre revisões

O projeto genoma humano, a necessidade de obter informações genéticas para medicina personalizada, o avanço da tecnologia e outras demandas impulsionaram o desenvolvimento de novas metodologias de sequenciamento com melhor qualidade, menor custo, maior rapidez e maior capacidade de geração de informações.<ref>THERMO FISHER SCIENTIFIC. '''Next-Generation Sequencing (NGS).''' Disponível em: <<nowiki>https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing.html</nowiki>>. Acesso em: 10 abr. 2018.</ref> Esses novos métodos pertencem ao grupo de Sequenciamento de Nova Geração (NGS, do inglês ''Next-Generation Sequencing''), podendo ser de segunda, terceira ou quarta geração.<ref>MARTINS, Cesar. '''The next generation sequencing.''' Botucatu: Unesp, 2013. Color.</ref> Dentre esses métodos, destacam-se o 454 Roche (pirossequeciamento), o Illumina, o Ion-torrent, o PacBio e o Nanopore.

 

Na maioria dos sequenciamentos, parte-se do princípio que a DNA polimerase irá adicionar nucleotídeos em uma fita de DNA complementar a uma fita molde. A identificação da ordem de quais nucleotídeos estão sendo incorporados permite o conhecimento da sequência da molécula em questão. A reação de adição de um nucleotídeo à molécula de DNA naturalmente causa liberação de H⁺ e, consequentemente, uma alteração no pH e na condutividade. No método Ion Torrent, vários segmentos de DNA a serem sequenciados estão dispostos em um chip contendo um sensor que detecta essa variação no pH e uma DNA polimerase. Um tipo de nucleotídeo (A, T, C ou G) é fornecido por vez ao chip. Se o segmento de DNA possui determinado nucleotídeo em sua sequência, nessa posição, ele será incorporado e a mudança de pH será detectada, do contrário, não ocorrerá reação de incorporação e nenhuma alteração é detectada. Assim é possível saber qual nucleotídeo foi adicionado. Ciclos de fornecimento de A, T, C e G são constantemente repetidos até que todos os segmentos tenham suas fitas complementares formadas e a sequência obtida. Devido a essa detecção direta, Ion Torrent é um método de sequenciamento bastante rápido. <ref>LIFE TECHNOLOGIES. '''Ion Torrent Amplicon Sequencing.''' Disponível em: <<nowiki>http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/applied_markets_marketing/documents/generaldocuments/cms_094273.pdf</nowiki>>. Acesso em: 10 abr. 2018.</ref>

 

Outros sequenciamentos de segunda geração são: 454 Roche e Illumina.

 

O método de PacBio utiliza uma única molécula de DNA de fita simples que é submetida a replicação por DNA polimerase imobilizada em um micro poço. Durante a replicação, são utilizados nucleotídeos marcados com fluoróforos de diferentes cores. A medida que os nucleotídeos vão sendo incorporados, os fluoróforos são liberados, causando emissão de luz em um comprimento de onda específico. A luz é detectada, e como a adição de cada nucleotídeo resulta em uma fluorescência diferente, é possível identificar a ordem de adição dos nucleotídeos e, portanto, obter a sequência da molécula de DNA. PacBio é considerado uma metodologia de alta acurácia. <ref>PACBIO. '''Smart Sequencing.''' Disponível em: <<nowiki>https://www.pacb.com/smrt-science/smrt-sequencing/</nowiki>>. Acesso em: 10 abr. 2018.</ref>

 

O NanoPore é um dos métodos de sequenciamento mais recentes e oferece diversas vantagens. O sequenciamento é realizado em um dispositivo portátil e pequeno, que contém uma entrada USB que permite o carregamento dos dados a qualquer momento. Não há incorporação de nucleotídeos nessa metodologia e a sua praticidade permite que sequenciamentos sejam realizados de maneira rápida em qualquer ambiente sem a necessidade de muitos recursos. Nessa metodologia, uma única fita da molécula de DNA é induzida a passar por um nano poro presente em uma membrana. A cada base nucleotídica constituinte da molécula que passa pelo poro, é detectada uma alteração na amperagem, que será característica de cada base, permitindo o sequenciamento.  <ref>OXFORD NANOPORE TECHNOLOGIES. '''DNA: nanopore sequencing.''' Disponível em: <<nowiki>https://nanoporetech.com/applications/dna-nanopore-sequencing</nowiki>>. Acesso em: 10 abr. 2018.</ref>