Era dia de Natal, em 1567. Pouco antes da meia noite do dia 18 de janeiro, seu pai e mais quatro membros ativos do conselho de estado entraram em silêncio no quarto do príncipe, e capturaram todas as armas e documentos no quarto. O príncipe se mexeu e perguntou, ainda com sono: "Quem está aí?" A resposta não demorou: "O Conselho do Estado". Dom Carlos ergueu-se e viu o pai, em armadura. "Vossa majestade veio me matar?", perguntou. Filipe tranquilizou-o. Os assistentes retiraram todos os objetos pesados e pregaram as janelas. Filipe disse que não o trataria mais como pai e sim como Rei. Os conselheiros e o rei deixaram o local. O príncipe permaneceu trancado em uma torre do Alcázar.<ref>{{citar livro|título=Filipe da Espanha.|ultimo=|primeiro=|editora=Record|ano=2003|local=Rio de Janeiro|páginas=183|acessodata=}}</ref>
Finalmente, em Janeiro de 1568 D. Carlos é mandado encarcerar por Filipe II. Numa carta à sua tia, a rainha de Portugal D. Catarina, este dá a entender que a prisão, mais do que um mero castigo ou um correctivo destinado a mudar as suas atitudes, tinha um carácter definitivo. O príncipe estava pois excluído da sucessão.
