Recombinação Cre-Lox
Recombinação Cre-Lox é uma tecnologia de recombinação sítio-específica, cujo nome vem do uso da enzima Cre recombinase e sítios loxP[1]. Derivada do mecanismo natural de recombinação do bacteriófago P1[2], a recombinação Cre-Lox é utilizada para diversos usos científicos e tecnológicos, notavelmente inserções, deleções, inversões e translocações sítio-específicas em sequências de DNA. Diz-se que uma sequência é “floxed” quando está flanqueada por sítios Lox.
Um dos usos mais conhecidos da recombinação Cre-Lox é a criação de animais knockout condicionais[3], onde a modificação desejada ocorrerá apenas após um estímulo desejado. Isso permite a alteração de sequências de DNA em tecidos específicos ou em momentos específicos do desenvolvimento, driblando possíveis efeitos letais se a alteração ocorresse globalmente.
Histórico
editarEste tipo especial de recombinação sítio-específica foi desenvolvida primeiramente pelo Dr. Brian Sauer, usada ativando expressão gênica em células de mamífero[4][5]. Sequencialmente, pesquisadores no laboratório do Dr. Jamey Marth demonstraram que a recombinação Cre-Lox poderia ser usada para deletar sequências de DNA flanqueadas por sítios loxP em eficiências altas em células T de animais transgênicos, com os autores propondo que essa abordagem poderia ser usada para definir a função gênica endógena em tipos celulares específicos, marcar progenitores em estudos de determinação de destino celular, induzir rearranjos cromossômicos específicos para modelagem biológica e de doenças e determinar os papéis de lesões genéticas precoces na manutenção de doenças[5].
Logo depois, pesquisadores no laboratório do Prof. Klaus Rajewsky relataram a produção de células iPS carregando um gene de DNA polimerase flanqueado por loxP[6]. Combinando esses avanços em colaboração, os laboratórios dos Drs. Marth e Rajewsky relataram em 1994 que a recombinação Cre-Lox poderia ser usada para modificação condicional de genes em células T em desenvolvimento em camundongos[7]. Eles observaram que aproximadamente 50% do gene da DNA polimerase beta havia sido deletado. Ainda estava incerto se apenas um alelo havia sido deletado em cada célula T ou se metade das células T haviam delatedo ambos os alelos.. Pesquisadores relataram então recombinação Cre-Lox condicional mais eficiente no laboratório Marth em 1995[8]. Deleção incompleta de genes em células com dois alelos flanqueados por sítios loxP não é incomum.
Independentemente, Joe Z. Tsien foi pioneiro no uso do sistema Cre-Lox para manipulação de modo específico a nível de célula e região no cérebro adulto, onde centenas de tipos neuronais podem existir e onde quase todos os neurônios no adulto são pós-mitóticos[9]. Tsien e colaboradores mostraram que recombinação mediada por Cre pode ocorrer nos neurônios piramidais pós-mitóticos no cérebro de camundongos adultos[10].
Esses avanços levaram a um uso generalizado de mutagênese condicional em pesquisa biomédica, afetando diversas disciplinas, se tornando uma poderosa ferramenta para determinar função gênica em tipos celulares específicos e em momentos específicos do desenvolvimento.
Componentes
editarCre recombinase
editarA proteína Cre (assim nomeada pela abreviação de "causes recombination" ou "cyclization recombinase")[11][12] tem 343 aminoácidos e consiste de 4 subunidades e dois domínios: um domínio C-terminal maior e um N-terminal menor. O domínio C-terminal tem estrutura similar a domínios na família de integrases isolada de bacteriófago λ, e também é o sítio catalítico dessa enzima[13].
Sítios LoxP
editarOs sítios loxP são sequências de 34 pb, consistindo de duas sequências simétricas de 13 pb flanqueando uma sequência assimétrica de 8 pb, portando sendo dotados de direcionalidade, o que define como a enzima irá modificar a sequência. A recombinação pode ocorrer tanto in cis como in trans, o que abre também possibilidades de troca de sequências ou integração com plasmídeos.
Para alguns usos é necessário fazer múltiplas recombinações no mesmo organismo em sítios diferentes. Para isso são usados sítios loxP alternativos, que possuem sua sequência central modificada[14]. A Cre recombinase irá interagir ao mesmo tempo apenas com sítios com sequências assimétricas iguais, criando a possibilidade de um sistema com recombinações múltiplas que não interferem umas nas outras (ortogonais).
Nome | Região simétrica de 13pb | Região assimétrica de 8pb | Região simétrica de 13pb |
---|---|---|---|
Selvagem | ATAACTTCGTATA | ATGTATGC | TATACGAAGTTAT |
lox 511 | ATAACTTCGTATA | ATGTATaC | TATACGAAGTTAT |
lox 5171 | ATAACTTCGTATA | ATGTgTaC | TATACGAAGTTAT |
lox 2272 | ATAACTTCGTATA | AaGTATcC | TATACGAAGTTAT |
M2 | ATAACTTCGTATA | AgaaAcca | TATACGAAGTTAT |
M3 | ATAACTTCGTATA | taaTACCA | TATACGAAGTTAT |
M7 | ATAACTTCGTATA | AgaTAGAA | TATACGAAGTTAT |
M11 | ATAACTTCGTATA | AGATAGAA | TATACGAAGTTAT |
lox 71 | TACCGTTCGTATA | NNNTANNN | TATACGAAGTTAT |
lox 66 | ATAACTTCGTATA | NNNTANNN | TATACGAACGGTA |
Mecanismo
editarA Cre recombinase atua nos sítios loxP ligando-se nas regiões simétricas nas bordas dos sítios, formando um dímero. O corte da fita de DNA será feito de acordo com sua direcionalidade, definida pela sequência assimétrica no meio desse sítio[15]. Esse dímero irá então se associar a outro dímero de Cre recombinase, formando um tetrâmero, promovendo o corte de uma das fitas de DNA e, junto à ação de DNA ligase, a criação de um intermediário de junção de Holliday[16]. As fitas simples geradas podem então ser alongadas por uma DNA polimerase para terminar o rearranjo das sequências, gerando deleções, inversões e translocações.
Animais Nocaute
editarMuitos fatores durante o desenvolvimento podem exibir funções múltiplas em locais diferentes do organismo, ou em momentos diferentes da ontogenia, dependendo do contexto em que se encontra. É possível portanto que a criação de um animal nocaute para alguma função específica seja inviável, se o que exerce essa função tem papel vital em outro momento da ontogenia ou em outro órgão ou tecido corporal. Por isso se dá a importância de uma tecnologia capaz de fazer deleções tecido-específicas em momentos específicos, dependendo de um input externo.
Normalmente são feitos animais nocaute pelo cruzamento de linhagens de animais modificadas, uma com a alteração em questão, a sequência floxed, e outra com expressão de Cre recombinase. É possível fazer deleção condicional através do uso de uma recombinase expressa por um promotor condicional ou com ação tecido-específica[17]. Deste modo apenas aquelas células que conseguirem ativar o promotor irão ter a sequência floxed modificada.
Outra forma de controle espacial da deleção é a injeção de Cre recombinase viral manualmente através de vetores de adenovírus ou lentivírus, tornando a expressão de Cre tão específica quanto a capacidade de isolar áreas a serem infectadas com vetores virais[18].
O controle temporal de expressão de Cre é mais utilizado com dois sistemas: indução por tetraciclina ou por tamoxifeno. O controle por teraciclina advém do mecanismo bacteriano de resistência a tetraciclina, composto pela proteína tetR e a sequência de DNA operador tetO. O sistema pode ser arranjado para levar à expressão de Cre na ausência ou presença de tetraciclina ou doxiciclina (Tet-Off e Tet-On, respectivamente). O sistema indutível por tamoxifeno funciona à base da fusão da Cre recombinase a um domínio do receptor de estrogênio humano, que na ausência de tamoxifeno impede a entrada da enzima no núcleo da célula, impedindo recombinação. As alterações pela recombinase podem então ser controladas temporalmente de acordo com a administração de tamoxifeno. É importante ressaltar que estes sistemas podem apresentar expressão basal de Cre dependendo do contexto celular e levar a deleções não intencionais, podendo levar a problemas de viabilidade embrionária.
Referências
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- ↑ Sauer, Brian. «Inducible Gene Targeting in Mice Using the Cre/loxSystem». Methods. 14 (4): 381–392. doi:10.1006/meth.1998.0593
- ↑ Sauer, B. (1 de junho de 1987). «Functional expression of the cre-lox site-specific recombination system in the yeast Saccharomyces cerevisiae.». Molecular and Cellular Biology (em inglês). 7 (6): 2087–2096. ISSN 0270-7306. PMID 3037344. doi:10.1128/mcb.7.6.2087
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- ↑ Gu, Hua; Zou, Yong-Rui; Rajewsky, Klaus. «Independent control of immunoglobulin switch recombination at individual switch regions evidenced through Cre-loxP-mediated gene targeting». Cell. 73 (6): 1155–1164. doi:10.1016/0092-8674(93)90644-6
- ↑ Gu, H.; Marth, J. D.; Orban, P. C.; Mossmann, H.; Rajewsky, K. (1 de julho de 1994). «Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting». Science (em inglês). 265 (5168): 103–106. ISSN 0036-8075. PMID 8016642. doi:10.1126/science.8016642
- ↑ Hennet, T.; Hagen, F. K.; Tabak, L. A.; Marth, J. D. (19 de dezembro de 1995). «T-cell-specific deletion of a polypeptide N-acetylgalactosaminyl-transferase gene by site-directed recombination». Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (26): 12070–12074. doi:10.1073/pnas.92.26.12070
- ↑ Tsien, Joe Z. (2016). «Cre-Lox Neurogenetics: 20 Years of Versatile Applications in Brain Research and Counting…». Frontiers in Genetics (em English). 7. ISSN 1664-8021. doi:10.3389/fgene.2016.00019
- ↑ Tsien, Joe Z; Chen, Dong Feng; Gerber, David; Tom, Cindy; Mercer, Eric H; Anderson, David J; Mayford, Mark; Kandel, Eric R; Tonegawa, Susumu. «Subregion- and Cell Type–Restricted Gene Knockout in Mouse Brain». Cell. 87 (7): 1317–1326. doi:10.1016/s0092-8674(00)81826-7
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- ↑ Lee, Linda; Sadowski, Paul D. «Sequence of the loxP Site Determines the Order of Strand Exchange by the Cre Recombinase». Journal of Molecular Biology. 326 (2): 397–412. doi:10.1016/s0022-2836(02)01429-8
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- ↑ Walrath, Jessica C.; Hawes, Jessica J.; Dyke, Terry Van; Reilly, Karlyne M. «Genetically Engineered Mouse Models in Cancer Research»: 113–164. doi:10.1016/s0065-230x(10)06004-5