Usuário:Yleite/Código de barras de DNA

Complexo científico da Universidade de Guelph, Ontário, Canadá.

O Código de Barras de DNA foi proposto em 2003, pelo pesquisador Paul Hebert da Universidade de Guelph, em Ontário, Canadá, como forma de identificar espécies conhecidas e descobrir novas utilizando variações em sequências curtas (800 pares de bases) de DNA. Isto é possível porque a variação dentro de cada espécie é relativamente baixa para as diferenças entre as espécies. Desde o seu desenvolvimento, a aplicação desta tecnologia de identificação taxonômica tem crescido em campos como o monitoramento da biodiversidade e reconstrução do ecossistema, assim como o uso emergente em saúde pública, agricultura, economia e comércio, e aplicação de leis ambientais. Os participantes na iniciativa de código de barras de DNA se apresentam na forma de consórcios, bancos de dados, redes, laboratórios e projetos que variam em tamanho, do âmbito local ao global. Os maiores consórcios são o iBOL (International Barcode of Life), o CBOL (Consortium for the Barcode of Life) e o ECBOL (European Consortium for the Barcode of Life). As iniciativas estão divididas em 4 centros: Canadá, China, União Europeia e os Estados Unidos; em 10 nós regionais: Argentina, Austrália, Brasil, Índia, Coréia, México, Nova Zelândia, Noruega, Rússia e África do Sul; e em 6 nós nacionais: Argentina, Colômbia, Costa Rica, Quênia, Madagascar e Panamá. Em países megadiversos como o Brasil, que abriga a maior diversidade biológica entre os 17 países considerados que reúnem 70% de espécies de animais e vegetais catalogadas no mundo, vê-se a necessidade de investimento em novas técnicas de identificação, pois estima-se que apenas 10% das cerca de 2 milhões de espécies da fauna e da flora brasileira já foram identificadas. Esta estimativa lenta é atribuída ao número reduzido de taxonomistas, técnicos em atividade e em número suficiente nos diferentes grupos de organismos e nas diferentes regiões do país, dificultando os inventários sobre a biodiversidade brasileira. Uma publicação ilustrada e traduzida intitulada Dez razões para ter o Código de Barras da Vida está disponível para o público no site da Universidade Rockefeller em NY, EUA.

Histórico

Instituto Smithsonian, Washington D.C, USA

O grupo de pesquisa de Paul Hebert da Universidade de Guelph publicou o artigo científico em 2003, onde eles propuseram um novo sistema de identificação e descobrimento de espécies utilizando um pequeno trecho de DNA de uma região padronizada do genoma. O Código de Barras de DNA foi criado para chamar a atenção da comunidade científica de que uma sequência de DNA pode ser usada para identificar diferentes espécies, da mesma maneira que um scanner de supermercado usa as listras pretas do código de barras UPC (Universal Product Code) para identificar suas compras. O primeiro workshop dessa iniciativa, intitulado "DNA e Taxonomia", ocorreu de 9 a 12 de março de 2003 no Laboratório Cold Spring Harbor (New York, EUA) e patrocinado principalmente pela Alfred P. Sloan Foundation. O artigo produzido após o workshop destacou as aplicações potenciais de tal técnica para a taxonomia e os potenciais benefícios para a sociedade, e se poderia ser provado em uma ampla variedade de grupos taxonômicos. De 10 a 12 setembro de 2003 acontecia a segunda oficina, intitulada "Taxonomia, DNA e do Código de Barras da Vida", realizada no Centro de Banbury (Inglaterra) e foi mais focado na discussão. Participantes desenvolveram um projeto internacional para o projeto Código de Barras da Vida (iBOL) que evoluiu rapidamente para uma proposta de doação pela Fundação Sloan. No mês de abril de 2004 a Fundação Sloan disponibilizou 669.000 dólares para o Instituto Smithsoniano para a criação e apoio de um Consórcio para o Código de Barras da Vida (CBOL), com o Dr. Scott Miller como o Investigador Principal. O CBOL realizou a sua reunião inaugural no Museu Nacional de História Natural do Instituto Smithsoniano em 24 maio de 2004. Em 2005 o CBOL realizou a Primeira Conferência Internacional do Código de Barras da Vida no Museu de História Natural de Londres. A Segunda Conferência Internacional do Código de Barras da Vida foi realizada na Academia Sinica em Taipei, Taiwan, em 2007. Em novembro de 2009 ocorria a Terceira Conferência Internacional de Código de Barras da Vida na Cidade do México, México. No ano de 2010 o iBOL foi criado para ampliar a cobertura geográfica e taxonômica da biblioteca de referência de código de barras - o Banco de Dados do Código de Barras da Vida (BOLD, do inglês: Barcode of Life Database) - armazenar os registros de código de barras resultantes, proporcionando o acesso da comunidade ao conhecimento que eles representam e criando novos dispositivos para garantir o acesso global a esta informação. As sequências obtidas são armazenadas no BOLD e de ano em ano desde 2009, sempre no mês de julho, são disponibilizadas no site para o público. Em julho de 2012 os registros de código de barras para animais foram de 1.478.304 sequências, mas a nível de espécie foram 1.203.700, de 113.614 espécies diferentes e 50.009 espécies com taxonomia provisória.

Objetivos do projeto

Até agora, as espécies biológicas foram identificadas utilizando características morfológicas como a forma, tamanho e cor de partes do corpo. Em alguns casos, um técnico ou estudante treinado poderia fazer identificações de rotina usando "chaves" morfológicas (instruções passo-a-passo do que procurar de acordo com as características dos espécimes), mas na maioria dos casos, é necessário um taxonomista experiente. Se uma amostra proveniente de herbários ou de coletas frescas estiver danificado ou está em um estágio imaturo de desenvolvimento pode dificultar até mesmo a identificação por um especialista. O Código de Barras resolve esses problemas, porque mesmo os não-especialistas podem obter códigos de barras a partir de pequenas quantidades de tecido. Portanto, pode servir a um propósito duplo como uma nova ferramenta na caixa de ferramentas taxonomistas completando seu conhecimento, bem como sendo um dispositivo inovador para os não-especialistas possibilitando uma rápida identificação. O código de barras pode auxiliar na compreensão da história de espécies de animais e de plantas. Alguns pesquisadores apresentam os resultados das análises de código de barras em árvores, indicando distâncias evolutivas e relações entre os grupos. Há séculos os biólogos têm buscado obter uma árvore da vida ou filogenia que mostra a história das espécies. Esses estudos se beneficiam da análise de vários caracteres, especialmente ao longo de várias eras e grupos. Nos poucos casos analisados até o momento, as distâncias genéticas entre os códigos de barras são congruentes com o conhecimento gerado pela taxonomia tradicional, indicando que a biblioteca de códigos de barras pode auxiliar em estudos evolutivos.

Atributos para a escolha da região do genoma

A região do genoma, cuja sequência pode ser utilizada como código de barras de DNA deve ser:

• Variável o suficiente para permitir a identificação de espécies, porém com baixo nível de variação intra-específica
• Universalmente amplificável e sequenciável com iniciadores (primers) padronizados
• Tecnicamente simples de sequenciar (não pode conter regiões com longas repetições de uma base)
• Curta o suficiente para permitir o sequenciamento em uma única reação de PCR com a tecnologia atual
• Facilmente alinhável (ou seja com poucas inserções e deleções – indels)
• Prontamente utilizável a partir de materiais de herbário e outras amostras degradadas de DNA (material forense, por ex.)

Regiões Candidatas a Código-de-barras de Plantas Terrestres

Holótipo da espécie Mimulus peregrinus com seu código de barras na excata.

A região do gene que está sendo usado por quase todos os grupos de animais é de 648 pb do gene mitocondrial citocromo c oxidase 1 ("CO1"), e está se mostrando altamente eficaz na identificação de pássaros, borboletas, peixes, moscas e outros grupos de animais. A vantagem de usar COI é que a região é curta o suficiente para ser sequenciada de forma rápida e barata e ainda longa o suficiente para identificar variações entre as espécies. Seqüências de DNA mitocondrial têm sido utilizadas há vinte anos em estudos de diferenciação de espécies próximas de animais, devido ao fato de que possuem seu próprio genoma e a diferença de seqüências entre espécies próximas são 5 a 10 vezes maiores em genes mitocondriais do que em genes nucleares. A variação intraespecífica do DNA mitocondrial é pequena na maioria das espécies animais, o que pode ser conseqüência da rápida perda de polimorfismos ancestrais devido à herança materna ou a varredura seletiva após a origem de mutações vantajosas. Pequenas diferenças intraespecíficas e grandes interespecíficas resultam em limites genéticos entre a maioria das espécies, permitindo a sua identificação. Os genes mitocondriais de animais raramente possuem íntrons (seqüências não codificadoras dispersas entre regiões codificadoras de um gene). Assim, é geralmente fácil obter a amplificação de DNA mitocondrial.O código de barras COI não é eficaz para a identificação de plantas, pois elas evoluem muito lentamente, mas duas regiões do gene no cloroplasto, matK(Maturase K) e rbcL(Ribulose bisphosphate carboxylase), foram aprovadas como as regiões de código de barras para as plantas terrestres.

Em plantas terrestres, uma região de plastoma (genoma do plastídio, que nesse caso é o cloroplasto) é a alternativa lógica em relação ao gene mitocondrial COI. Os genomas de plastoma apresentam uma ordem de genes conservada, um grande número de cópias e regiões variáveis de espaçadores (intercalam os genes) e íntrons que oferecem o potencial para desenvolvimento de primers flanqueando regiões polimórficas. Por isso, esses genes poderão ser facilmente amplificáveis e sequenciáveis em grupos taxonômicos pouco relacionados evolutivamente e deverão funcionar em DNA degradado. O DNA de plastoma em plantas terrestres, entretanto, é caracterizado por baixas taxas de divergência em comparação com o DNA mitocondrial de outros organismos.

Estrutura do Projeto

Excata de Periandra mediterranea - Herbário Ezechias Paulo Heringer. Exemplar de fonte de DNA para extração

Termociclador. usado nas Reaçoes em Cadeia da Polimerase(PCR)

Análise de sequências amplificadas

• Os espécimes: museus de história natural, herbários, jardins zoológicos, aquários, coleções de tecidos congelados, bancos de sementes, coleções tipo de cultura e outros repositórios de materiais biológicos são a fonte dos exemplares identificados.
• Análise em Laboratório : nos laboratório os protocolos criados para se obter sequências de código de barras de DNA devem ser seguidos. Os melhores laboratórios de biologia molecular equipados podem produzir uma sequência de código de barras de DNA em algumas horas. Os dados são então colocados numa base de dados para análise posterior.
• A Base de dados: um dos componentes mais importantes da iniciativa do código de barras é a construção de uma biblioteca de referência pública em que as espécies catalogadas podem ser utilizadas para designar as amostras desconhecidas. Existem atualmente como principais bases de dados a parceria entre GenBank, o EMBL (European Molecular Biology Lab)e o DDBJ (DNA Data Bank of Japan), além do Banco de Dados da Vida (BOLD) na Universidade de Guelph, em Ontário.
• A análise dos dados: as amostras são identificadas quando encontradas no registro de referência mais próximo correspondente no banco de dados. Grupo CBOL criou um Portal de dados que oferece aos pesquisadores novas e mais flexíveis formas para armazenar, gerenciar, analisar e exibir seus dados de código de barras.

Laboratórios

CCDB, Canadian Centre for DNA barcoding da Universidade de Guelph, é a maior "fábrica de código de barras", gerando centenas de milhares de registros de dados por ano e o treinamento de pesquisadores de código de barras de todo o mundo. O CBOL organizou uma Rede de 15 Laboratórios em 11 países que prestam assistência técnica e treinamento para os outros e para novas instituições participantes do projeto. O material genético analisado nos laboratórios é obtido através de tecnicas de PCR (Polymerase Chain Reaction). Após a extração do DNA utilizando-se o detergente catiônico CTAB (brometo de cetil-trimetilamônio), método de Doyle & Doyle (1987), ou kits de extração o DNA precisa ser quantificado em espectofotômetro, o que nos fornece margem de segurança para subseqüente amplificação por PCR. Em seguida com o material genético é realizada a eletroforese em gel de poliacrilamida ou agarose. Os resultados obtidos satisfatoriamente são submetidos a sequenciamento através de equipamentos e mão de obra qualificada. Os laboratórios participantes do projeto devem possuir todo o equipamento necessário para otimizar a obtenção dos dados, entretanto, é possível terceirizar a etapa de sequenciamento. A etapa seguinte é o alinhamento das sequencias de pares de bases.

Banco de dados

BOLD, o sistema de dados do Código de Barras da Vida, da Universidade de Guelph, é uma bancada pública para projetos de código de barras. Pesquisadores podem montar, testar e analisar seus registros de dados em negrito antes de enviá-los para o INSDC International Nucleotide Sequence Database Collaboration que compõem o Banco de Dados de Colaboração Internacional entre o GenBank, o EMBL, e o DDBJ . Eles são o repositório público permanente para registros de dados de código de barras.

Foram estabelecidas algumas condições pelo CBOL para confecção e utilização de um banco de dados de Códigos de Barras de DNA:

• Pelo menos cinco amostras de referência para cada espécie;
• As amostras devem ser preferencialmente de diferentes localidades;
• Todas as amostras devem ter material testemunho (voucher) com imagens digitalizadas publicamente disponíveis;
• As buscas devem ser realizadas por um software específico, chamado BOLD.

Usando o Código de Barras

Atteva aurea. Uma das epécies de lepidoptera que já possui seu Código de Barras de DNA

As atividades internacionais como FISH BOL ou os 10 Grupos de Trabalho iBOL , podem representar os esforços de um indivíduo ou de um grupo de pesquisa de pequeno porte. Os projetos trabalham com vários grupos de animais invertebrados e vertebrados, além de bactérias, protozoários, fungos e plantas. Alguns exemplos são o CBOL Fungal Working Group, Bee Barcode of Life iniciative (BEE-BOL), Lepdoptera Barcode of Life, Mammalia Barcode of Life Campaign, Marine Barcode of Life (MarBOL), CBOL Protist Working Group (ProWG), HealthBOL que coordena iniciativas de Código de Barras de vetores, patógenos e parasitas para a melhoria da saúde humana em todo o mundo. Com o projeto espera-se uma grande melhoria na capacidade de monitorar e gerenciar a biodiversidade, com profundos impactos sociais e econômicos. Isto revolucionaria a nossa capacidade de realizar inventários de diversidade tanto em velocidade, como em praticidade, além de abrir uma gama de aplicações em todas as ciências que dependem da identificação de organismos como ferramenta auxiliar (ecologia, fisiologia etc.). Outro uso óbvio deste tipo de identificação seria em órgãos fiscalizadores, permitindo identificação fácil de madeiras e outros materiais extrativos vegetais, bem como plantas ameaçadas de extinção, podendo também ser utilizado no controle de pragas agrícolas e espécies invasoras.

Maiores limitações do Código de Barras

• Os grupos com baixa diversidade de seqüências podem dificultar a diferenciação dos espécimes. Embora uma comparação entre seqüências mitocondriais de 2238 espécies de 11 filos animais revelou que 98% de pares de espécies próximas apresentam mais de 2% de diferenças em suas seqüências, o que seria suficiente para identificar corretamente a maioria das espécies.
• A observação de diferenças entre espécies com divergência recente é difícil de ser obtida usando qualquer método, inclusive morfologia. Em alguns casos, o código de barras mitocondrial pode chegar ao limite de identificação entre duas (ou mais) espécies próximas. A freqüência de espécies com o mesmo código de barras é baixa dentro dos grupos analisados até o momento.
• A híbridação (junção de material genético pertencente a espécies diferentes). comum na natureza leva a insegurança quanto a identificação baseada em um único gene (nuclear ou mitocondrial).
• Pseudogenes nucleares (cópias inativas de genes que geralmente possuem várias mutações e/ou deleções) podem complicar a identificação baseada em genes mitocondriais e nucleares.

Iniciativas para o Código de Barras de DNA

Entre as iniciativas no mundo a Canadian Barcode of Life Network e o Museu Nacional do Instituto Smithsonian de História Natural se destacam com inúmeros subprojetos voltados para muitos filos animais, plantas, fungos e protistas. Com objetivos taxonômicos, evolutivos, auxíliando nas inferências filogenéticas, econômicos, com o tratamento de pragas agrícolas e como ferramenta no cultivo, e ecológicos, especialmente para manejo de espécies ameaçadas e espécies invasoras. Em abril de 2010 teve início O Sistema de Espelho Global de Dados de Código de Barras de DNA(GMS-DBD), desenvolvido pelo Centro de Informação de Rede, Instituto de Microbiologia da Academia Chinesa de Ciências. As instituições federais de ensino por todo o Brasil, orgãos e empresas públicas e privadas participam da Brazilian Barcode of Life(BrBOL)iniciativa brasileira que associa o país com o iBOL. Os avanços no desenvolvimento da técnica e os como se daria o processo da iniciativa internacional foram o foco da discussão do Simpósio Internacional sobre DNA Barcoding do Programa Biota-FAPESP, que teve início no dia 3 de dezembro de 2009, na sede da Fundação, em São Paulo. De acordo com uma das coordenadoras do simpósio, Mariana Cabral de Oliveira, do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (USP), o evento marcou a entrada efetiva da comunidade científica brasileira na iniciativa global para o desenvolvimento da nova ferramenta, e disse à Agencia da FAPESP:“Há um esforço internacional sendo feito para a aplicação dessa ferramenta em todas as espécies. Há pesquisadores brasileiros colaborando com o grupo do Canadá que está encabeçando o projeto mundial de DNA barcoding, mas essa participação ainda é individualizada. A ideia é que o Brasil entre nisso de forma mais ampla e efetiva”. Pesquisadores de 25 países participam da iniciativa, que pretendia compilar, em códigos de barras de DNA, cerca de 5 milhões de amostras de 500 mil espécies nos próximos cinco anos. “Desde 2005, estamos compilando cerca de meio milhão de amostras a cada dois anos. Mas o trabalho está apenas começando. No futuro esperamos ter sistemas automatizados que apoiem as identificações de grandes numeros de espécies”, disse Paul Hebert, que abriu a programação do Simpósio palestrando sobre a técnica do DNA Barcoding proposta por ele. Além da FAPESP outras instituições entraram na iniciativa, como a Fiocruz, que através do Centro de Pesquisa René Rachou (CPqRR/Fiocruz Minas) integrará um dos nove subprojetos inseridos na Rede Brasileira de Identificação Molecular da Biodiversidade (BrBol). Em Notícia a Agencia de Notícias Fiocruz divulgou em 2011 que a instituição faria parte da subárea de Identificação Molecular de Parasitos e Vetores do Brasil, pretendendo gerar códigos de barras de DNA de aproximadamente 1,2 mil espécies (ou exatamente 6.634 espécimes).

Ligações externas

• Barcode of Life Data Systems
• International Barcode of Life
• Consortium for the Barcode of Life
• European Consortium for the Barcode of Life
• FISH BOL
• Canadian Barcode of Life Network