Técnica de Ziehl-Neelsen
A coloração ou técnica de Ziehl-Neelsen, abreviada na literatura muitas vezes como ZN, é uma técnica de coloração de bactérias mais agressiva que a técnica de Gram, sendo usada em bactérias que não são bem coradas com esta técnica, como os bacilos da lepra e da tuberculose, as bactérias dos gêneros Mycobacterium e Nocardia, entre outros. Foi desenvolvida por Franz Ziehl e posteriormente melhorada por Friedrich Neelsen, no final do século XIX.[1][2][3][4]
Técnica de Ziehl-Neelsen
editarHá bactérias que são resistentes à coloração, mas que uma vez coradas vão resistir fortemente à descoloração, mesmo por ácidos fortes diluídos e álcool absoluto. Às bactérias que possuem esta propriedade dizemos que são ácido-álcool resistentes, (BAAR) (géneros Mycobacterium e Nocardia). Esta característica é devida ao elevado teor de lípidos estruturais (ex. ácido micólico) na parede celular destas bactérias, que provoca uma grande hidrofobicidade, dificultando a ação dos mordentes e diferenciadores de corantes aquosos.
A técnica de Ziehl-Neelsen evidencia esta ácido-álcool resistência. Entretanto, a álcool- ácido resistência é variável entre as espécies e implica em uma alteração na técnica. No caso do Mycobacterium tuberculosis a técnica segue o seguinte protocolo:
- Confeccionar o esfregaço seguindo as técnicas atuais de biossegurança[5];
- Cobrir a lâmina com fucsina fenicada 0,3%(o mordente é o ácido fénico);
- Aquecer a lâmina até à emissão de vapores (é importante não deixar ferver);
- Aguardar 3 minutos e repetir o processo de aquecer a lâmina outras 3 vezes;
- Lavar com água corrente;
- Cobrir a lâmina com álcool-ácido 3% até descorar totalmente o esfregaço;
- Lavar com água corrente;
- Cobrir a lâmina com azul de metileno durante 1 minuto;
- Lavar com água corrente;
- Secar;
- Observar em imersão.
No caso do Mycobacterium leprae a técnica segue o seguinte protocolo:
- Confeccionar o esfregaço seguindo as técnicas atuais de biossegurança;[6]
- Cobrir a lâmina por 20 minutos com fucsina fenicada 1% (o mordente é o ácido fénico);
- Lavar com água corrente;
- Cobrir a lâmina com álcool-ácido 1% até descorar totalmente o esfregaço;
- Lavar com água corrente;
- Cobrir a lâmina com azul de metileno 0,3% durante 5 minutos;
- Lavar com água corrente;
- Secar;
- Observar em imersão.
A fucsina fenicada, atuando a quente, vai corar todas as células bacterianas e outras estruturas presentes no esfregaço de vermelho (o calor vai derreter os lípidos de membrana, tornando-a permeável). O ácido diluído em álcool aplicados vão descorar todas as bactérias exceto as ácido-álcool resistentes, que permanecem coradas de vermelho pela fucsina. Assim, ao serem observadas após coloração e contraste, com azul de metileno, encontraremos as bactérias:
- Ácido-álcool resistentes: coradas de vermelho.
- Não ácido-álcool resistentes: coradas de azul.
Preparação para a Coloração
editarNa observação microscópica pós coloração o material a observar deve ser previamente fixado, o que facilita a observação de bactérias, uma vez que têm reduzidas dimensões, fraco contraste e algumas refringência e mobilidade.
A fixação é a coagulação do protoplasma bacteriano com o mínimo de deformação e sua colagem à lâmina. Como exemplos de agentes fixadores temos o calor, o formol e o éter.
A coloração recorre do uso de corantes e permite aumentar o contraste e evidenciar a estrutura bacteriana. Estes são compostos orgânicos, com um ou mais anéis benzénicos que se encontram ligados a dois grupos funcionais, o cromóforo que é responsável pela cor do corante e o auxócromo que se dissocia ionicamente em solução dotando o corante de capacidade para reagir com os tecidos, células e estruturas celulares. Podemos diferenciar dois tipos de corantes; os corantes ácidos (são negativos formando sais com cátions) e os corantes básicos (são positivos formando sais com ânions). Como as bactérias possuem carga elétrica negativa existe afinidade entre os corantes básicos e as estruturas celulares da bactéria permitindo que esta fique corada. Para reforçar a ação do corante, aumentando a força de ligação deste às estruturas celulares utilizam-se mordentes como o ácido tânico, o ácido crômico, o ácido fénico, o iodo (Soluto de Lugol), o calor e os álcalis. Os solutos corantes são compostos de várias substâncias sendo geralmente hidro-alcoólicos-fenicados porque além da substância corante possuem água para permitir a dissociação iônica do corante, álcool para conservar e ácido fénico que atua como mordente e como bacteriostático evitando a contaminação das soluções corantes. Após a aplicação do corante aplica-se um diferenciador que serve para retirar o excesso de corante (acetona, ácido sulfúrico, álcool 95º). Os diferenciadores têm a capacidade de descorar certas bactérias já previamente coradas e são usados em colorações policromáticas.
A preparação de colorações policromáticas segue um protocolo constante. Assim, sobre um esfregaço (células fixadas pelo calor), aplica-se:
- O primeiro corante
- O mordente
- O diferenciador
- Água (vai parar a diferenciação)
- O segundo corante (vai ser contrastante)
Aplicações
editarAs técnicas de coloração ácido-resistente, desenvolvidas inicialmente por Paul Ehrlich se baseiam na presença de ácidos micólicos, como as voltadas para a identificação do Mycobacterium tuberculosis[7] pela coloração de Ziehl Neilsen[8] e Kinyoun.[9]
Os esporos de Encephalitozoon cuniculi são coloridos com a coloração de Ziehl-Neelsen, os quais também apresentam afinidade com fucsina e azul de toluidina e a coloração azul de toluidina-fucsina.[10]
A coloração de Ziehl-Neelsen também encontra aplicação no diagnóstico de um fungo causador de dermatites assim como de feohifomicoses chamado Curvularia lunata.[11]
Referências
- ↑ Vinicius Mussi; Coloração de Ziehl-Neelsen - www.ageracaociencia.com
- ↑ Baron S, editor.; Medical Microbiology. 4th edition.; David N. McMurray.; Chapter 33 Mycobacteria and Nocardia; Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at Galveston; 1996.
- ↑ Martin Gengenbacher, and Stefan H. E. Kaufmann; Mycobacterium tuberculosis: Success through dormancy; FEMS Microbiol Rev. 2012 May; 36(3): 514–532. doi: 10.1111/j.1574-6976.2012.00331.x
- ↑ SILVANA TRIFIRO, ANNE-MARIE BOURGAULT, FRANÇOIS LEBEL, AND PIERRE RENÉ; Ghost Mycobacteria on Gram Stain; JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Jan. 1990, Vol. 28, No. 1, p. 146-147 - 0095-1137/90/010146-02$02.00/0
- ↑ «Manual de Recomendacoes e Controle da Ttuberculose no Brasil 2ª ed — Ministério da Saúde» (PDF). www.gov.br. Consultado em 27 de outubro de 2023
- ↑ Ministério da Saúde do Brasil (2010). «Guia de procedimentos técnicos: Baciloscopia em Hanseníase.» (PDF). Biblioteca Virtual em Saúde do Ministério da Saúde. ISBN 978-85-334-1678-9. Consultado em 27 de outubro de 2023
- ↑ «Coloração de bactérias - Estudo da forma e organização das bactérias. - www.uma.pt» (PDF). Consultado em 11 de junho de 2008. Arquivado do original (PDF) em 19 de abril de 2009
- ↑ «Métodos de Coloração Bacteriana - estudmed.com.sapo.pt». Consultado em 11 de junho de 2008. Arquivado do original em 10 de abril de 2008
- ↑ «PESQUISA DE BACILO ÁLCOOL - ÁCIDO RESISTENTE – BAAR - www.pncq.org.br». Consultado em 11 de junho de 2008. Arquivado do original em 30 de novembro de 2006
- ↑ Maria Anete Lallo Eduardo Fernandes Bondan José Guilherme Xavier Marisa Porta Miche Hirschfeld; Técnicas de coloração para detecção de Encephalitozoon cuniculi em cortes histológicos; Ciência Rural, Santa Maria, Online - ISSN 0103-8478
- ↑ Adesh shrivastavaa, Karuna Tadepallib, Garima Goelc, Kajal Guptab, Pradeep Kumar Guptab; Melanized fungus as an Epidural abscess: A diagnostic and therapeutic challenge; Medical Mycology Case Reports, Volume 16, June 2017, Pages 20–24.
Ligações externas
editar- «MÉTODO DE ZIEHL-NEELSEN PARA BACILOS ÁLCOOL-ÁCIDO RESISTENTES (tuberculose, lepra) - www.fcm.unicamp.br»
- Sumário de aula prática com aplicação da técnica
- Aplicação da coloração com fucsina pela técnica de Ziehl-Neelsen